凝膠層析技術(shù)中的主體——層析柱
更新時(shí)間:2020-04-24瀏覽:3252次
凝膠是一類(lèi)多孔性高分子聚合物,每個(gè)顆粒猶如一個(gè)篩子。當樣品溶液通過(guò)凝膠柱時(shí),相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著(zhù)凝膠顆粒間的空隙,隨著(zhù)溶劑流動(dòng),因此流程較短,向前移動(dòng)速度快而首先流出層析柱;反之,相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔,可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔,在向下移動(dòng)過(guò)程中,它們從凝膠內擴散到膠??紫逗笤龠M(jìn)入另一凝膠顆粒,如此不斷地進(jìn)入與逸出,使流量增長(cháng),移動(dòng)速率慢而后流出層析柱。而中等大小的分子,它們也能在凝膠顆粒內外分布,部分進(jìn)入顆粒,從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫。這樣,經(jīng)過(guò)層析柱,使混合物中的各物質(zhì)按其分子大小不同而被分離。
對生物樣品來(lái)說(shuō),經(jīng)常遇到的是兩種分離形式。一種是只將分子量極為懸殊的兩類(lèi)物質(zhì)分開(kāi),如蛋白質(zhì)與鹽類(lèi),稱(chēng)作類(lèi)分離或組分離。另一類(lèi)則是要將分子量相差不很大的大分子物質(zhì)加以分離,如分離血清球蛋白與白蛋白,這叫做分級分離。后者對實(shí)驗條件和操作要求都比較高。
1)類(lèi)分離
目的是分開(kāi)樣品中分子量懸殊的“較大分子組”和“較小分子組”兩類(lèi)物質(zhì),并不要求分離分子量相近的組分。
2)分級分離
目的是分開(kāi)分子量不是很懸殊的大分子物質(zhì)。選擇凝膠型號時(shí)必須使各種物質(zhì)的Kd(分離系數)值盡可能相差大一些。
層析柱是凝膠層析技術(shù)中的主體,一般用玻璃管或有機玻璃管。層析柱的直徑大小不影響分離度,樣品用量大,可加大柱的直徑,一般制備用凝膠柱,直徑大于2厘米,但在加樣時(shí)應將樣品均勻分布于凝膠柱床面上。此外,直徑加大,洗脫液體體積增大,樣品稀釋度大。分離度取決于柱高,為分離不同組分,凝膠柱床必須有適宜的高度,分離度與柱高的平方根相關(guān),但由于軟凝膠柱過(guò)高擠壓變形阻塞,一般不超過(guò)1米。分族分離時(shí)用短柱,一般凝膠柱長(cháng)20-30厘米,柱高與直徑的比較5:1─10:1,凝膠床體積為樣品溶液體積的4-10倍。 分級分離時(shí)柱高與直徑之線(xiàn)為20:1─100:1,常用凝膠柱有50×25厘米,10×25厘米。濾板下的死體積應盡可能的小,如果支掌濾板下的死體積大,被分離組分之間重新混合的可能性就大,其結果是影響洗脫峰形,出現拖尾出象,降低分辯力。在精確分離時(shí),死體積不能超過(guò)總床體積的1/1000。